1. ¿Qué es la tinción de Ziehl-Neelsen/BAAR?

                              ¿Qué es la tinción de Ziehl-Neelsen / BAAR?

La tinción de Ziehl Neelsen (ZN), es una técnica de coloración diferencial que permite la identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). Entre los BAAR se encuentran las micobacterias, agentes etiológicos de enfermedades como la tuberculosis (TBC) y la lepra. 

Las micobacterias son un grupo de microorganismos de gran importancia clínica, ya que varias de sus especies son la causa de diversas infecciones humanas tales como la tuberculosis y la lepra con una relevante morbilidad y mortalidad. 

No todas las micobacterias son patógenas aunque en determinadas ocasiones pueden comportarse como microorganismos oportunistas en pacientes inmunocomprometidos e incluso inmunocompetentes llegando a producir la enfermedad. Las denominadas micobacterias atípicas o ambientales pueden hallarse en el suelo, el agua, o en productos de animales.

2. La Historia de Origen de la Tinción de BAAR

La Historia de Origen de la Tinción de BAAR

La tinción de Bacilo Acido-alcohol resistente (BAAR) tiene sus antecedentes a finales del siglo XIX en la época conocida como la época de oro de la microbiología. 

En 1878  el medico noruego Armauer Hansen observo el bacilo que lleva su nombre al impregnarlo con acido osmio en un extendido de lepromas y observo filamentos color pardo libres en el extendido. En 1882 el microbiólogo alemán Robert Koch logro teñir el bacilo de la tuberculosis con solución alcohólica concentrada de azul de metileno alcalino, seguido por la tinción de Bismarck con Vesuvia, observando que los bacilos se teñían de color azul intenso y el tejido junto con otras bacterias de color pardo. (De Naranjo, P. et al, 1988)

En mayo de 1882 Paul Ehrlich a partir de lo propuesto por Koch, implemento su método en el carácter alcohol-ácido resistente del bacilo tuberculoso, utilizando ácido nítrico y coloreando con violeta de genciana, fortificada por la presencia de anilina disuelta en agua. (Walter, L., 2003)

En agosto de 1882 el bacteriólogo alemán Franz Ziehl, cambio el mordiente de Ehrlich por acido carbólico, dando un paso practico y fácil de reproducir. En julio de 1883 Friedrich Neelsen implemento el uso de la fucsina en acido carbólico obteniendo buenos resultados y determino la concentración de este a 5%. Para este entonces el colorante de fucsina y el mordiente de acido carbólico con alcohol eran las sustancias esenciales para obtener resultados satisfactorios. (De Naranjo, P., et al, 1988)

Hasta nuestros tiempos el procedimiento de la técnica de tinción seguían los pasos propuestos por Franz Ziehl y Friedrich Neelsen, es por ello que se les atribuye la técnica de tinción de Ziehl-Neelsen o tinción de Bacilo acido-alcohol resistente (BAAR). 

Figura 2.1 Friedrich Neelsen

 

Figura 2.2 Franz Ziehl

Referencias:

• De Naranjo, P., Rodriguez, G., Rodriguez, J., & Caldas, M. (1988). La coloración de Ziehl-Neelsen en Histopatología. BIOMEDICA, 8(2 y 3), 84–93. https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/download/1964/1988

• LEDERMANN D., WALTER. (2003). En los 500 años del descubrimiento: Colones y Pinzones de la microbiología. Revista chilena de infectología, 20(Supl. notashist), 18-20. https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182003020200004.

• LEDERMANN D., WALTER. (2003). La tuberculosis después del descubrimiento de Koch. Revista chilena de infectología, 20(Supl. notashist), 48-50. https://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182003020200015

3. Fundamento de la Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR)

"El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos."

(Briceño, K. 2021)

Estos ácidos tienen la característica principal de presentar cadenas muy largas, lo que les otorga la capacidad de retener los colorantes con mayor facilidad. Esta característica hace que algunas bacterias sean algo difíciles de teñir mediante la tinción de Gram.

(Briceño, K. 2021)

Figura 3.1- Estructura de la pared celular de bacterias ácido-alcohol resistentes. (UDC, 2018)

La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza como colorante principal carbol fucsina, un compuesto fenólico con propiedades básicas con la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular. La tinción con carbol fucsina es mejorada al calentar la solución, pues la capa cerosa que forman los ácidos grasos se derrite facilitando que las moléculas del colorante se muevan con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.

(Briceño, K. 2021)

Figura 3.2- Formula estructural del colorante Fucsina ácida.

Al finalizar la tinción con el colorante principal se realiza un lavado con alcohol ácido para remover el colorante de las células que no fueron teñidas debido a que si pared celular no era lo suficientemente afín al colorante. Las células que resisten a esta decoloración son conocidas como ácido-resistentes. Finalmente se utiliza un colorante de contraste (generalmente azul de metileno o verde malaquita) para teñir las células que no resistieron a la decoloración don el alcohol-ácido.

(De Naranjo, P. et al, 1988)

En recapitulación, este es un proceso útil para diferenciar entre bacterias que poseen altas concentraciones de ácidos grasos en sus paredes celulares. Algunas bacterias de interés que presentan dichas características son Mycobacterium tuberculosis y  Mycobacterium leprae.

(Briceño, K. 2021)

Figura 3.3- Mycobacterium tuberculosis visualizada con tinción de Ziehl-Neelsen. (Briceño, K. 2021)

Referencias:

• Anónimo. (18 de enero de 2018). Estructura de la pared celular de bacterias ácido-alcohol resistentes [pdf]. HUDEPDF. recuperado 20 de marzo de 2022, de: https://hugepdf.com/download/estructura-de-la-pared-celular-de-bacterias-acido_pdf

• Briceño, Katherine. (19 de febrero de 2021). Tinción de Ziehl-Neelsen. Lifeder. Recuperado 20 de marzo de 2022, de: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/

• De Naranjo, P., Rodriguez, G., Rodriguez, J., & Caldas, M. (1988). La coloración de Ziehl-Neelsen en Histopatología. BIOMEDICA, 8(2 y 3), 84–93. https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/download/1964/1988

4. Tinción Bacilos Ácido-alcohol Resistentes (BAAR)

Reactivos y Colorantes:

• Fucsina Fenicada
• Alcohol ácido (alcohol de 95% y ac. clorhídrico conc.)
• Azul de metileno o verde de malaquita.

Metodología:

• Colocar la muestra de exudado con un isopo, pasando este por encima del portaobjetos dejando una cantidad mínima de muestra, de preferencia que haya tenido contacto con los fluidos del paciente.
• Fijar la muestra pasando el portaobjetos 3 veces por encima de la flama del mechero, con la cara contraria de donde se colocó la muestra mirando hacia abajo.
• Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar hasta que emita vapores; mantenerla así durante 5 minutos. Añadir colorante repetidas veces para evitar que se deseque sobre la lámina. (Smith, D. & Martin, D., 1951)

Figura 4.1 Cubrir la totalidad del portaobjetos con Fucsina Fenicada.

Figura 4.2 Calentar por 5 minutos con una torunda bañada en alcohol.

• Lavar con agua. (Smith, D. & Martin, D., 1951)

Figura  4.3 Realizar lavado con agua  en posición de canto.

• Decolorar con alcohol clorhídrico hasta que las partes menos espesas queden incoloras. (Smith, D. & Martin, D., 1951)

Figura 4.4 Decolorar con alcohol ácido

• Lavar con agua. (Smith, D. & Martin, D., 1951)

• Teñir con azul de metileno de 10 a 30 segundos. (Smith, D. & Martin, D., 1951)

Figura 4.5 Cubrir el portaobjetos en su totalidad con azul de metileno.

• Lavar con agua. (Smith, D. & Martin, D., 1951)

• Secar al aire.(Smith, D. & Martin, D., 1951)

Figura 4.6 Frotis pintado con tinción de Gram observado en el objetivo 100x con aceite de inmersión.